顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性判斷

實(shí)驗(yàn)/實(shí)習(xí)目的

當(dāng)顯微鏡下細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要觀察顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)情形與計(jì)數(shù)顯微鏡下細(xì)胞，可以決

定是否為良好顯微鏡下細(xì)胞或者為死掉顯微鏡下細(xì)胞，方可繼續(xù)繼代顯微鏡下細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)/實(shí)習(xí)原理

組織培養(yǎng)顯微鏡下細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有

限的，所以當(dāng)達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分顯微鏡下細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)/實(shí)習(xí)藥品與設(shè)備

1、 無(wú)菌操作檯

2、 血球計(jì)數(shù)盤(pán)

(一)0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

(二)取0.4 gram trypan blue 溶于100 ml Ca2+ / 1Mg2+ free 1x phosphate

buffer saline (1 x PBS) 經(jīng)0.2μm 孔徑過(guò)濾器過(guò)濾后即可使用

3、 血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)

4、 計(jì)數(shù)器(counter)

5、 低倍倒立顯微鏡

實(shí)驗(yàn)/實(shí)習(xí)內(nèi)容與步驟

1、 血球計(jì)數(shù)盤(pán)：

(一)血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers。

(二)每個(gè)chamber深度均為0.1mm。

(三)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形。

(四)其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格。

(五)當(dāng)chamber上方蓋上特製血球計(jì)數(shù)盤(pán)蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為

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1mm2 x 0.1mm=1.0 x10-4ml。

(六)使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之顯微鏡下細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，

即為每ml中之顯微鏡下細(xì)胞數(shù)目。

2、 trypan blue exclusion存活測(cè)試：

(一)最常用之顯微鏡下細(xì)胞存活測(cè)試之原理為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死顯微鏡下細(xì)胞

中而呈色，而活顯微鏡下細(xì)胞因顯微鏡下細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。

(二)操作上一般使用藍(lán)色之trypan blue染料。

(三)如果顯微鏡下細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

3、

存活測(cè)試步驟：

(一)均勻打散顯微鏡下細(xì)胞成顯微鏡下細(xì)胞懸浮液。

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(二)剪出一小片石蠟?zāi)ぁ?/p>

(三)取20ml 0.4% trypan blue 于石蠟?zāi)ど稀?/p>

(四)取20ml 顯微鏡下細(xì)胞懸浮液與石蠟?zāi)ど蟭rypan blue 做等體積溷合均勻溷合。

(五)取少許溷合液﹙約20ml﹚自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻

片，于100倍顯微鏡下觀察(10x物鏡10x目鏡)。

(六)活顯微鏡下細(xì)胞不染色，呈現(xiàn)透明顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，死顯微鏡下細(xì)胞則被染為藍(lán)色。

(七)一般需分別計(jì)數(shù)3~5個(gè)大方格之活顯微鏡下細(xì)胞數(shù)以及死顯微鏡下細(xì)胞數(shù)，再除計(jì)數(shù)之大

方格數(shù)。

(八)一大格顯微鏡下細(xì)胞平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)﹙乘以2，因與trypan blue等體積溷合﹚，

最后乘以104，即為每ml中顯微鏡下細(xì)胞懸浮液之顯微鏡下細(xì)胞數(shù)。

(九)若有顯微鏡下細(xì)胞位于邊線上，只計(jì)上線與右線之顯微鏡下細(xì)胞﹙或計(jì)下線與左線之顯微鏡下細(xì)胞﹚。

(十)4大格*顯微鏡下細(xì)胞總數(shù)/ 4 (大格) x 2 (稀釋倍數(shù)) x 104 = 顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/ml。

*每一大格的體積 = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm =1 x 10-4 ml。

(十一)也可用Coulter counter自動(dòng)粒子計(jì)數(shù)器作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無(wú)法辨別死顯微鏡下細(xì)胞

或活顯微鏡下細(xì)胞。

4、 范例：

1.T75 monolayer culture製成10ml顯微鏡下細(xì)胞懸浮液，取0.02 ml溶液與0.02ml

trypan blue溷合均勻于試管中，取少許溷合液加入血球計(jì)數(shù)盤(pán)，計(jì)數(shù)四大

方格內(nèi)之顯微鏡下細(xì)胞數(shù)目。

(1).活顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/方格：55、62、49、59。

(2).死顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/方格：5、3、4、6。

(3).顯微鏡下細(xì)胞總數(shù) = 243。

(4).平均顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/方格 = 60.75。

(5).稀釋倍數(shù) = 2。

(6).顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 cells/ml。

(7).顯微鏡下細(xì)胞數(shù)/flask：1.22 x 106 x 10ml = 1.22 x 107 cells/flask。

(8).存活率：225 / 243 x 100％ ﹦92.6 ％。

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注意事項(xiàng)

1、 顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)之誤差：

(一)取樣不均勻。

(二)顯微鏡下細(xì)胞充分溷合。

(三)顯微鏡下細(xì)胞分布均勻。

(四)每一大格約10~60個(gè)顯微鏡下細(xì)胞取樣誤差比較小。

(五)稀釋或濃縮。

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